1、適用范圍

適用于《2020版中國(guó)藥典一部》中蜂蜜中寡糖的鑒定。

2、測(cè)試原理

試樣中的高分子糖，經(jīng)活性炭-硅藻土柱的富集、濃縮，再用薄層色譜法分離、檢測(cè)。經(jīng)過與摻有一定含量的麥芽五糖的純蜂蜜比較，來(lái)判定蜂蜜中寡糖的存在。

3、所需耗材和試劑

標(biāo)準(zhǔn)品： 純蜂蜜、麥芽五糖

樣品：陽(yáng)性蜂蜜

試劑： 乙醇(分析純)、正丁醇(分析純)、乙酸(分析純)、二苯胺(CAS: 537-67-7)、丙酮(分析純)、苯胺、磷酸(優(yōu)級(jí)純)、超純水。

薄層板：硅膠G板200mm×200mm，膜厚0.25mm。使用前應(yīng)畫板，畫板方法為下端留2cm，薄層板的寬度為2.5cm，從下端處向上量3.5cm位置畫線，此線為Rf值，從下端2cm處向上量10cm位置畫線，此為爬板終點(diǎn)線，爬過此線視為爬板過程結(jié)束。畫好板后需要在110 ℃恒溫干燥箱中活化1h后，置于干燥器中放冷至室溫，備用。

固相萃取柱：月旭Welchrom® HON蜂蜜專用柱，規(guī)格：500mg/12mL

4、實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 SPE 前處理步驟

活化：25mL水，過柱流速1滴/秒；

上樣：在50mL燒杯中稱取2g試樣，精確到1mg，溶于10mL水后，緩慢加到月旭Welchrom® HON蜂蜜專用柱上；

淋洗：25mL 7%乙醇水；

洗脫：10mL 50%乙醇水，收集洗脫液；

濃縮及復(fù)溶：收集的洗脫液置于65℃水浴中減壓濃縮至干，殘?jiān)尤?0%乙醇1mL使之溶解，作為供試品溶液。(溶解時(shí)候要注意確保殘?jiān)?復(fù)溶)；

麥芽五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：取麥芽五糖對(duì)照品，加30%乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

注：

1) 整個(gè)SPE過小柱的前處理過程都需要用固相萃取真空裝置，抽取一定的真空度以確保液體能夠滴出小柱；

2) 旋蒸濃縮的時(shí)候應(yīng)使用盡可能小體積的茄形瓶，推薦用25mL規(guī)格，以防止復(fù)溶的時(shí)候因接觸面積過大而損失樣品；可以少量多次地添加溶劑進(jìn)行復(fù)溶；

3) 用超純水活化小柱時(shí)，注意在液面下降至

小柱填料上端時(shí)，即可添加樣品溶液上樣，切記活化過程中不能將液面抽干，否則會(huì)影響小柱對(duì)寡糖的保留效果。

4.2  點(diǎn)板條件

TLC板：薄層色譜用硅膠板(涂層厚度0.2-0.25mm)

展開劑：正丙醇:水:三乙胺=60:30:0.7

顯色劑：稱取1.0g二苯胺鹽酸鹽置于盛有50.0mL丙酮的燒杯中，再加入1mL苯胺，混合攪拌，同時(shí)加入5mL 85%的磷酸，此時(shí)會(huì)有白色絮狀物出現(xiàn)，*溶解后可以使用，此顯色劑要現(xiàn)用現(xiàn)配，各種試劑要按照以上順序添加。

注：

顯色劑的添加順序一定要按照順序添加，不可顛倒。

4.3 具體點(diǎn)板過程

用10µL微量注射器在距離薄層板下端2cm的位置，點(diǎn)上3.0µL的樣液，同時(shí)另取一塊薄層板，點(diǎn)上同樣量經(jīng)過同樣處理的純蜂蜜和麥芽五糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對(duì)照。點(diǎn)樣時(shí)點(diǎn)越小、越集中爬板效果就越好。然后將其放置在展開槽中(在展開劑中進(jìn)行展開，使用250mL的廣口瓶作為展開缸，加入10mL展開劑即可)，待爬板結(jié)束后(一次跑板的時(shí)間大約需用時(shí)2.5h)，用吹風(fēng)機(jī)將薄層板吹干后，均勻噴涂顯色劑，再次吹干后，放置到110℃的烘箱中烘烤20-30min（烘烤至顯色），觀察顯色后的TLC板的效果。

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與判斷標(biāo)準(zhǔn)

從恒溫干燥箱中取出薄層板，觀察TLC板的顯色情況，純蜂蜜只在Rf值0.35以上的區(qū)域有2~3個(gè)藍(lán)色中帶灰色或咖啡色的斑點(diǎn)，相比較麥芽五糖或混有麥芽五糖的蜂蜜卻是從原點(diǎn)開始呈現(xiàn)藍(lán)色帶狀樣的斑點(diǎn)群。