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液相色譜,你問我答(十四)

更新時間:2022-04-15 點(diǎn)擊次數(shù):1430



什么是液相系統(tǒng)的梯度滯留體積?

它對分析有什么影響?


答:梯度滯留體積是梯度混合點(diǎn)到柱子進(jìn)口之間的體積。這個體積導(dǎo)致梯度有一定延遲,因而也叫做梯度延遲體積。

現(xiàn)在很多液相系統(tǒng)都是單泵低壓梯度系統(tǒng),就是說梯度是在泵的上游混合 的。梯度延遲體積的第一個部分是梯度混合器的體積。這樣,你就要加上梯度混 合器和泵頭之間的連接體積。第二個是泵頭的體積,然后是進(jìn)樣器的連接管路。通常,這個體積增大一點(diǎn)來充分混勻流動相而使梯度平滑一點(diǎn)。進(jìn)樣器到進(jìn)樣器 和柱頭之間的體積是另一個部分??纯丛谕ǔ5牡蛪禾荻认到y(tǒng)中,梯度滯留的地 方相當(dāng)多…

也可以再高壓一邊產(chǎn)生梯度。這最少需要2個泵,可以盡量減少梯度延遲體積。但是高壓梯度系統(tǒng)不是這樣設(shè)置的。通常,連接位置在進(jìn)樣器之前。好處是樣品不管怎么樣都能進(jìn)入柱子,而不用依賴哪個泵的流速。最好是用初始流動相來溶解樣品,這樣梯度延遲體積可以*不記了。這個技術(shù)的一個小缺點(diǎn)就是樣品會被流動相的第二個組分稀釋一點(diǎn)點(diǎn),但是如果初始流動相是90%的流動相A的話這個問題就很小了,只稀釋了10%。另一個問題是通常大部分峰會聚集在柱頭,這樣在開始的等度洗脫中只有一小部分峰被洗脫下來。這時,我們要確保進(jìn)樣器與柱頭之間的體積要足夠小。高壓梯度系統(tǒng)就沒有這種問題。

下面我們來討論一下梯度延遲體積怎樣影響分析!由于梯度到達(dá)柱子需要時間,因此梯度一開始就延遲了,開始這段時間就是跑等度。第一個影響就是前面 的峰換個系統(tǒng)后保留時間可能就不一樣了。如果梯度延遲時間比較明顯,那么色譜圖中前期的峰就會明顯不同,而梯度后期則與延遲體積不怎么相關(guān)。但是洗脫時間還是會隨梯度延遲時間改變。這些情況都很讓人頭疼。這就是為什么在QC實(shí)驗室中避免使用梯度的原因。畢竟樣品時通過保留時間來定性的,如果換儀器后保留時間不一樣,那么就不好判斷了。當(dāng)然也可以通過標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間來判斷,但是還是不叫復(fù)雜….



我同意,那確實(shí)有點(diǎn)復(fù)雜,但也不是

無法克服的。還有其他要考慮的嗎?


答:如果在低壓系統(tǒng)中混合體積較大,那么你觀察到的梯度圖譜不會很尖銳。這通常不會影響標(biāo)準(zhǔn)線性梯度,但是如果是階梯狀的梯度就會影響洗脫了。通常用延遲體積小的梯度系統(tǒng),現(xiàn)在很多HPLC系統(tǒng)的梯度延遲都很小。對于循環(huán)時間小的非??焖俚奶荻?,即使延遲體積再小也不夠。這時可以采 用延遲進(jìn)樣技術(shù)。理論上,梯度還是按通常的運(yùn)行,但是直到梯度到達(dá)進(jìn)樣器時才進(jìn)樣。這樣就想沒有梯度延遲體積一樣。當(dāng)然進(jìn)樣環(huán)以及進(jìn)樣器到柱頭的管路的體積還是有一定的延遲,但是小的可以忽略了。

當(dāng)梯度運(yùn)行完后,柱子會重新開始平衡,也是有延遲。所以我們不用等到柱子重新平衡好后再開始新的梯度,我們只要知道設(shè)計的程序,泵的運(yùn)行與柱頭實(shí)際發(fā)生的不一樣就行了。梯度運(yùn)行和柱子再平衡被排空梯度延遲體積抵消了。這個解決方法讓我們可以在單泵系統(tǒng)中實(shí)施沒有延遲的快速梯度。另外,如果在不同的儀器上運(yùn)行同樣的梯度,延遲體積造成的影響會很小。這樣我們就可以在不同的儀器上重復(fù)梯度。當(dāng)然,以上都是假設(shè)梯度發(fā)生器穩(wěn)定工作,可重復(fù)并且能確實(shí)按要求工作。



怎么測量梯度延遲體積呢?

怎么確定系統(tǒng)的梯度確實(shí)是想要的呢?


答:有個標(biāo)準(zhǔn)測試非常有用,參考《JJG 705 2014液相色譜儀檢定規(guī)程》中對梯度檢定的部分。不接柱子,在流動相B中加少量的UV吸收劑0.1%丙酮,然后運(yùn)行梯度。這可以觀察真實(shí)的梯度。從程序與實(shí)際的差別中可以檢測到系統(tǒng)的梯度延遲體積。如果你采用延遲進(jìn)樣,你就必須要了解這點(diǎn)。對系統(tǒng)了解的越多,在梯度分析中浪費(fèi)的時間就會越小。


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