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淺談尺寸排阻色譜法方法開發(fā)影響因素

更新時間:2022-08-08 點擊次數(shù):1501

尺寸排阻色譜法(SEC)是根據(jù)溶液中分子的大小分離化合物的,在柱子的填料中較大的分子會被較細的小孔排除在外。當(dāng)以有機溶劑作為流動相,使用合成聚合物填料時,SEC就涉及凝膠滲透色譜(GPC)。在以水緩沖液為流動相和使用親水性柱填料分離生物聚合物(例如蛋白質(zhì))時,SEC就稱為凝膠過濾色譜。凝膠過濾色譜可作為用以分離生物活性物質(zhì)(通常等同于在多個純化步驟中其他的色譜技術(shù))的前處理工具,或者亦可作為獲取溶質(zhì)分子信息的工具,包括分子大小或形狀、聚集狀態(tài)、生物聚合物與其配體結(jié)合的動力學(xué)參數(shù)。

過去凝膠過濾色譜一般采用葡聚糖、瓊脂糖或者聚丙烯酰胺等軟凝膠作為填料。對于可壓縮的填料,必須根據(jù)流動相的流速選用適合的重力或者低壓泵。軟凝膠可以通過交聯(lián)作用提高穩(wěn)定性,這樣就可以承受更高的流速和幾兆帕的壓強。凝膠過濾色譜分析時常用的剛性載體是:以親水性固定相修飾的硅膠基質(zhì)或者交聯(lián)的有機聚合物。這些物質(zhì)能在HPLC系統(tǒng)中使用,其機械強度可以承受幾十兆帕或更高的壓強。




尺寸排阻色譜法(SEC),顧名思義,它的基本原理就是當(dāng)目標分析物進入凝膠滲透色譜柱,大體積的分子由于比凝膠顆粒的孔隙大不能進入孔隙,只能在凝膠顆粒之間的空隙流過,最先被淋洗出來;中等體積的分子部分可以進入凝膠顆粒的孔隙,并經(jīng)顆粒間的空隙流過,淋洗出來的順序在大體積分子和小分子之間;體積較小的分子比凝膠顆粒的孔隙小,可以進入凝膠顆粒的空隙,并在凝膠顆粒的孔隙以及顆粒之間的空隙不斷進入出來擴散,速度最慢,所以是最后被淋洗出來的。當(dāng)確定儀器型號和實驗所需條件后,化合物的淋出體積就與其分子量有關(guān),分子量越大,其淋洗體積越小,具體分離原理如圖。

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Xtimate® SEC色譜柱是月旭推出的硅膠基質(zhì)的體積排阻系列色譜柱,其色譜填料為高純度、具有良好穩(wěn)定性的硅膠微球表面鍵合親水性聚合物。月旭科技采用特殊的表面修飾技術(shù),確保了該填料具有良好的穩(wěn)定性和批次重現(xiàn)性。

尺寸排阻色譜是根據(jù)溶液中分子量大小分離的,其保留時間取決于溶質(zhì)分子進出固定相孔結(jié)構(gòu)的相對滲透度。然而這個是在理想狀態(tài)下的分離情況,色譜柱內(nèi)還存在其他次級作用力,對目標物的分離產(chǎn)生影響。

因此,以Xtimate® SEC色譜柱做方法開發(fā)時,需要注意以下幾點因素:

1

分子量

可根據(jù)目標物的分子量,來選擇合適孔徑的色譜柱。

2

樣品與流動相

為避免色譜柱堵塞,所有樣品和溶劑,包括緩沖鹽,都必須在使用前用0.45μm或0.22μm濾膜過濾。Xtimate® SEC可以使用水或有機溶劑與水的混合物,與大多數(shù)緩沖鹽溶液也兼容。流動相使用前需脫氣,否則可能出現(xiàn)柱壓和基線波動較大。這時可用較大流速沖洗色譜柱2-5min,如對于7.8mm*300mm的色譜柱,可用1.25mL/min的流速。

3

離子強度

色譜柱中不可避免會存在其他次級作用力,為了最大限度降低填料與被測物的次級作用力,必須調(diào)整流動相的離子強度。NaCl是SEC分離中比較常用的鹽,可通過調(diào)整離子強度,減少次級作用力,進而改善峰形和分離效果。

4

pH

流動相的pH調(diào)整,更多也是為了減少色譜柱中的次級作用對被測物的影響,所以測定過程中需選擇合適的pH。為獲得最佳分離效果和延長使用壽命,建議使用pH在2-7.5范圍內(nèi)的流動相。

5

壓力

盡管Xtimate® SEC可在高至3000psi 的壓力下使用,但正常的操作壓力應(yīng)當(dāng)?shù)陀?500psi。長時間在高壓下運行會損壞色譜柱和輸液泵。由于壓力來源于流速,因此最大流速將受制于系統(tǒng)所能承受的壓力。一般而言,柱壓會隨著色譜柱使用時間的增加而逐漸增加。 

6

流速

盡量采用低流速測試,可以提高分離度,進而獲得更好的測試效果。內(nèi)徑為4.6mm和7.8mm的色譜柱,一般建議其正常操作流速分別為0.1-0.4mL/min和0.1-1.25mL/min。

7

柱長

通過增加色譜柱的長度可以改善SEC分離度,所以在分離過程中,在一根色譜柱達不到分離效果時,可以考慮兩根色譜柱串聯(lián),甚至不同孔徑的色譜柱串聯(lián)(注:一般大孔徑的在前,小孔徑的在后)。這種條件下通常也會造成出峰時間延后,及系統(tǒng)壓力增加。

8

柱溫

最高操作溫度為80℃。為了獲得最長的使用時間,最佳操作溫度為10-30℃。長時間在高溫(>80℃)下操作也會損壞色譜柱,這種情形在高的 pH(>7.5)條件下尤其突出。

9

日常維護

隨著使用次數(shù)的增加,某些樣品可能吸附到入口篩板或填料上。當(dāng)積累到一定程度時會出現(xiàn)壓力升高,并伴隨峰形異常等現(xiàn)象。因此,日常使用過程中需要經(jīng)常注意對色譜柱進行沖洗和維護,以達到最佳的分離效果和延長使用壽命。

產(chǎn)品信息

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